美國Biozellen3D細胞培養基質膠使用步驟：

A、試劑制備

A基質膠：將A基質膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘， 確認*融解.

C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10X C緩沖溶液用冰的無細胞培養液(例如： 無血清DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D細胞培養基質膠的制備

全部步驟需要在無菌環境內操作，操作步驟如下：

1. 將24孔培養板放置于冰上預冷半小時。

2. 細胞計數后取 2×105~2×107 細胞與 0.5 毫升 37℃ 細胞培養基均勻混合，并與0.5毫升37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合，最終細胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：請選擇適當的培養溶液與條件進行試驗。

3.取 20-40 微升步驟 2的混合液滴于 步驟 1 預冷的培養板上，膠體將于 5 分鐘內成膠。 注: 測試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進行確認。

4.待膠體成膠后，添加1毫升冰的1X C緩沖溶液，并蓋過步驟3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5.待15分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細胞生長之培養基溶液。

6將含有細胞的膠于37°C 二氧化碳培養箱內進行7~14天的培養，并觀察細胞球體的形成，按正常培養基更換頻率進行更換操作。

C、溶膠與收集細胞球體準備程序

小心的將培養基吸取移除，并用1X PBS進行清洗。

小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應 5分鐘。

溫和的用1毫升移液管吸取，直到膠滴*溶解。

將含有細胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管，用1000 rpm的轉速離心10分鐘，移除上清液體并收集細胞球體做分析。

D、收集單顆細胞準備程序

在分離單細胞前，先按上述溶膠與收集細胞球體準備程序進行操作

1. 添加trypsin-EDTA并與收集的細胞球體于37°C混合反應。

2. 用1毫升移液管混合，直到細胞體*分解。

3. 待細胞球體*分解，加入3倍體積的1X PBS，并用1000轉的轉速進行離心10分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細胞做分析。

E、細胞遷移實驗準備程序

1. 準備Transwell裝置及無血清DMEM細胞培養液 (用于稀釋A膠)。

2. A膠 (2X) (貨號:B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認*融解。

3. 用無血清DMEM細胞培養液將A膠 (2X)稀釋50倍。

4. 根據Transwell上室底部面積加入100-120 ul/cm2稀釋后的A 膠稀釋液到Transwell上室中。

5. 將步驟4在4 ℃冰箱孵育30分鐘。

6. 將多余的稀釋液吸出，并在Transwell上室中加入無血清的癌細胞系細胞懸浮液使細胞濃度約7.5 x 104 cells/well.。

7. 在Transwell下室中加入含10 %血清的細胞培養液做為chemoattractant，吸引癌細胞系進行遷移。

F、小鼠皮下成瘤實驗準備程序

1. 將 A膠 (2X) (貨號:B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認*融解。

2. 將C緩沖溶液(10X) 貨號:B-P-00002-C)與冰的無血清細胞培養液 (例如: 無血清DMEM或內含VEGF、heparin的無血清DMEM) 按1:4比例均勻混合配置。(例如:1 ml C緩沖溶液(10X) 與 4 ml 無血清DMEM混合，不可用PBS稀釋)

3. 將 A膠 (2X) 與約2*106 cells/ml的癌細胞系懸浮液按1:1等比例均勻混合配置，癌細胞系懸浮液最終濃度約為106 cells/ml。

4. 選用21-25 G的針頭 (避免破壞細胞)，抽取0.2-0.3 ml 預冷稀釋后的C緩沖溶液。(C緩沖溶液用于A膠成膠反應)

5. 使用步驟4的同一支針管，再抽取0.1-0.7 ml含細胞的A膠混合液，在冰上孵育五分鐘。

6. 以皮下注射方式注射0.3-1.0 ml至小鼠。(需一次注射完含C緩沖溶液的A膠混合液)

注1: 注射體積可依不同實驗目的做調整，若為血管生成研究注射體積需至少0.5 ml。

注2: 此步驟依實驗需求可執行或不執行，若需呈現明顯的皮下注射隆起效果，可于注射完畢后，在小鼠注射部位冰敷5-10分鐘

，若需呈現明顯的皮下注射隆起效果，可于注射完畢后，在小鼠注射部位冰敷5-10分鐘。

7. 培養一至三周后可摘取接種的腫瘤組織。

注3: 若為血管生成研究，應注射含VEGF及heparin的A膠，以促進血管生成。約三天后，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。